磷酸化蛋白檢測(cè)試劑盒首先用熱堿將磷酸化蛋白中的磷酸基團(tuán)水解下來(lái)，再通過(guò)染料分子與游離的磷酸分子結(jié)合，形成染料-磷酸復(fù)合物。本試劑盒具有操作簡(jiǎn)單快速、定量范圍大、線性好和實(shí)驗(yàn)方案靈活等特點(diǎn)。
1.選取18個(gè)酶標(biāo)孔，分為標(biāo)準(zhǔn)組和樣品組，依次分別標(biāo)號(hào)1-7,8-9，均設(shè)置重復(fù)管號(hào)。樣品實(shí)驗(yàn)前可做適當(dāng)稀釋或濃縮，樣品可取2個(gè)不同濃度梯度。標(biāo)號(hào)為8-9。標(biāo)準(zhǔn)組各管分別加入50 μl各濃度的磷酸化標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液；樣品組分別加入50μl磷酸化蛋白樣品。
2.各管加入50 μl 2.0 mol/L NaOH，混勻。 65℃水浴，保溫30 min。
3.待溶液冷卻至室溫后，各管加入50 μl 4.7 mol/L HCl，混勻。
4.各管加入50 μl檢測(cè)液，混勻。室溫靜置30 min，期間混勻1-2次，進(jìn)行吸光度值檢測(cè)前再混勻1次。
5.以0號(hào)管作為空白對(duì)照，在分光光度計(jì)上測(cè)各管的A620值。
6.以標(biāo)準(zhǔn)組各管A620平均值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的磷酸化標(biāo)準(zhǔn)蛋白終濃度為橫坐標(biāo)，在酶標(biāo)儀上或Microsoft Excel軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由樣品管各管A620平均值計(jì)算樣品中磷酸化蛋白的濃度。

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磷酸化蛋白檢測(cè)試劑盒采用酶標(biāo)儀法的具體步驟